proNGF/大鼠神經(jīng)生長因子前體檢測試劑盒
簡介  
神經(jīng)生長因子（NGF）是由一個前體，即proNGF生成的，該前體經(jīng)過了蛋白加工。NGF優(yōu)先結合營養(yǎng)性激酶受體TrkA，而proNGF則結合神經(jīng)營養(yǎng)素受體（NTR）p75NTR，后者可具有神經(jīng)毒性活性。嚴重的早期基底前腦能神經(jīng)元（BFCN）退化是阿爾茨海默病（AD）的一個標志。BFCNs的生存、連接和功能依賴于神經(jīng)營養(yǎng)素神經(jīng)生長因子（NGF），它從其在大腦皮層和海馬的合成部位逆行運輸。在健康的大腦中，BFCNs同時表達TrkA 和p75NTR，proNGF是神經(jīng)營養(yǎng)性的，激活TrkA依賴的信號通路，如MAPK 和Akt-mTOR，并引起細胞存活和神經(jīng)元的生長。然而，如果TrkA消失或p75NTR增加，proNGF會激活p75NTR依賴的凋亡途徑，如JNK。這種受體敏感性作為一個神經(jīng)營養(yǎng)/凋亡開關，消除了不能維持TrkA/p75NTR平衡的 BFCNs，從而與它們的目標進行突觸連接。TrkA在輕度認知障礙（MCI）和AD中日益喪失。此外，proNGF在皮質(zhì)和海馬的BFCN終端積累，減少了到達 BFCN細胞體的營養(yǎng)因子的數(shù)量。TrkA的喪失和proNGF的積累發(fā)生在MCI的早期，并與認知障礙相關。proNGF水平的增加和TrkA水平的降低導致BFCN神經(jīng)變性和最終p75NTR依賴性的凋亡。

本試劑盒大鼠proNGF免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的大鼠proNGF。試劑盒包含大腸桿菌表達重組大鼠proNGF和針對重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然大鼠proNGF獲得的結果顯示出與使用重組標準品獲得的標準曲線平行的線性曲線。這些結果表明，該試劑盒可用于測定天然大鼠proNGF的相對質(zhì)量值。

檢測原理

試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物proNGF，孵育清洗后，再加入標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中proNGF的濃度。
操作要點

1. 混合蛋白質(zhì)溶液時，應始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。此外，每種試劑應單獨使用容器。

2. 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準確的結果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。

3. 當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。

4. 顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應從無色變?yōu)樗{色。

5. 應按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、眼睛和面部防護用品，處理后洗手。

試劑準備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
proNGF/大鼠神經(jīng)生長因子前體檢測試劑盒
標準品配置

試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從10ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至500pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的500pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將500pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為： 500pg/mL、 250pg/mL、 125pg/mL、 62.5pg/mL、 31.25pg/mL、  15.63pg/mL、 7.81pg/mL，從濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)

結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。

本圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為3.91pg/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別天然和重組大鼠proNGF。

其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。

實驗步驟匯總 
1. 加標準品及樣品，37℃避光反應1.5h，洗滌3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應1h，洗滌4次。

3. 加酶結合物，37℃避光反應30分鐘，洗滌4次。

4. 加顯色液，37℃避光反應15分鐘。

5. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

大鼠神經(jīng)生長因子前體用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中大鼠的proNGF使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書，大鼠ELISA試劑盒僅供科研使用，不能于其它診斷。