在運(yùn)用ELISA方法測定抗體方面，通常所用的方法稱為間接法，也是目前常用的方法，其原理：間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，(對人的標(biāo)本來說即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色，底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結(jié)果可用目測或用分光光度計定量測定。
操作步驟：
1. 將抗原按5μg/ml稀釋于碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)，100μl /孔，4℃過夜。
2. 次日PBS－T清洗4次(快1慢3，間隔5分鐘)。
3. 加2％BSA封閉室溫1h，200μl /孔。
4. 陽性對照從10ug/ml，做倍必稀釋，待測血清從1：50做倍比稀釋，預(yù)試驗后確定稀釋倍數(shù)及陽性對照的起始濃度及稀釋數(shù)量(以可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線為參數(shù))，室溫1h。
5. PBS－T清洗4次(快1慢3，間隔5分鐘)。
6. 加入1：3000(不同公司有不同的推薦稀釋度)PBS-T稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，100μl /孔，室溫1h。
7. PBS－T清洗4次(快1慢3，間隔5分鐘)。
8. 顯色，100μl /孔，顏色變深后中止顯色，2M硫酸在BIO-RAD酶標(biāo)儀上讀數(shù)，可用ABTS，OPD，TMB等。
在線咨詢